Pet moči:
● Instrument, konfiguriran s korakom ekstrakcije nukleinske kisline in čiščenja
● Instrument, konfiguriran z modulom za ultrazvočno ekstrakcijo
● Instrument je popolnoma avtomatsko konfiguriran
● Instrument, konfiguriran s spremenljivim temperaturnim ojačanjem
● Instrument, konfiguriran s popolnoma zaprtim kompletom reagenta
1. Ali je treba reagente za odkrivanje nukleinskih kislin ekstrahirati in prečistiti?
Načelo odkrivanja nukleinske kisline je naslednje: pod delovanjem primerja se DNA polimeraza uporabi za izvedbo pomnoževanja verižne reakcije na matrični DNA/RNA (ki zahteva reverzno transkripcijo NA), nato pa se zazna količina sproščenega fluorescenčnega signala, da se določi ali vzorec vsebuje nukleinsko kislino (DNA/RNA) patogena, ki ga je treba detektirati.
1) Vzorci, ki niso bili ekstrahirani ali prečiščeni, lahko vsebujejo številne komponente, ki vplivajo na končni rezultat: nukleazo (ki lahko raztopi ciljno nukleinsko kislino in povzroči lažno negativno), proteazo (ki lahko zmanjša DNA polimerazo in povzroči lažno negativno), težke kovine sol (ki povzroči inaktivacijo sintaze in povzroči lažno pozitiven rezultat), preveč kisel ali preveč alkalni PH (ki lahko povzroči neuspeh reakcije), nepopolna RNA (povzroči lažno negativno napako povratne transkripcije).
2)Nekatere vzorce je težko neposredno pomnožiti: po Gramu pozitivni in nekateri paraziti zaradi svojih debelih celičnih sten in drugih struktur, če ne gredo skozi postopek ekstrakcije in čiščenja nukleinske kisline, lahko komplet brez ekstrakcije odpove vzorcev.
Zato je priporočljivo izbrati testni komplet ali instrument, ki je konfiguriran s korakom ekstrakcije nukleinske kisline.
2. Kemična ekstrakcija ali fizična ultrazvočna fragmentacijska ekstrakcija?
Na splošno lahko kemično ekstrakcijo uporabimo za večino predobdelave in čiščenja.Vendar pa je pri debelostenskih po Gramu pozitivnih bakterijah in nekaterih parazitih tudi tako, da kemična ekstrakcija ne more pridobiti učinkovitih predlog nukleinske kisline, kar ima za posledico lažno negativno detekcijo.Poleg tega se pri kemični ekstrakciji pogosto uporabljajo močna sredstva; če elucija ni temeljita, je v reakcijski sistem enostavno vnesti močno alkalijo, kar ima za posledico netočne rezultate.
Ultrazvočna fragmentacija uporablja fizično drobljenje, ki ga je uspešno uporabil GeneXpert, vodilno podjetje na področju POCT za uporabo pri ljudeh, in ima absolutno prednost pri ekstrakciji nukleinske kisline nekaterih kompleksnih vzorcev (kot je Mycobacterium tuberculosis).
Zato je priporočljivo izbrati testni komplet ali instrument, ki je konfiguriran s korakom ekstrakcije nukleinske kisline.in optimalno je, če obstaja ultrazvočni ekstrakcijski modul.
3. Ročno, polavtomatsko in popolnoma avtomatsko?
To je problem stroškov dela in delovne učinkovitosti.Trenutno so bolnišnice za hišne ljubljenčke brez dovolj osebja, ekstrakcija in odkrivanje nukleinske kisline pa je delo, ki zahteva določene veščine in izkušnje.Nobenega dvoma ni, da je popolnoma samodejni stroj za ekstrakcijo in odkrivanje nukleinske kisline odlična izbira.
4. Konstantno povečanje temperature ali spremenljivo povečanje temperature?
Reakcija pomnoževanja je povezava za odkrivanje nukleinske kisline in profesionalna tehnologija, vključena v to povezavo, je zapletena.Grobo rečeno, encimi se uporabljajo za pomnoževanje nukleinske kisline.V procesu pomnoževanja se zazna ojačen fluorescenčni signal ali vgrajeni fluorescenčni signal.Na splošno velja, da prej kot se pojavi fluorescenčni signal, večja je vsebnost ciljnega gena v vzorcu.
Pomnoževanje s konstantno temperaturo je pomnoževanje nukleinske kisline pri fiksni temperaturi, medtem ko je pomnoževanje s spremenljivo temperaturo ciklično pomnoževanje strogo v skladu z denaturacijo-žarjenjem-podaljšanjem.Izveden je bil čas ojačanja s konstantno temperaturo, medtem ko na čas ojačanja s spremenljivo temperaturo močno vpliva hitrost dviga in padca temperature instrumenta (trenutno je mnogim proizvajalcem uspelo izvesti 40 ciklov ojačanja v približno 30 minutah).
Če so laboratorijski pogoji dobri in je coniranje strogo, je razumno reči, da razlika v natančnosti med obema ne bo velika.Vendar bo pomnoževanje s spremenljivo temperaturo sintetiziralo več produktov nukleinske kisline v relativno krajšem času.Za laboratorije brez strogega določanja območij in strokovnega usposabljanja osebja bo tveganje za uhajanje aerosola nukleinske kisline večje, lažno pozitiven rezultat se pojavi, ko pride do uhajanja, kar je zelo težko odpraviti.
Poleg tega je pomnoževanje s konstantno temperaturo bolj nagnjeno k nespecifičnemu pomnoževanju, ko je vzorec kompleksen (relativna reakcijska temperatura je nižja in višja kot je temperatura podaljška, boljša je specifičnost vezave primerja).
Kar zadeva trenutno tehnologijo, je ojačanje s spremenljivo temperaturo bolj zanesljivo.
5. Kako se izogniti tveganju uhajanja produktov za pomnoževanje nukleinskih kislin?
Trenutno mnogi proizvajalci izberejo cev za PCR tipa žleze kot reakcijsko cev za nukleinsko kislino, ki je zatesnjena s trenjem, temperaturna denaturacija pri denaturaciji s spremenljivo temperaturo pri pomnoževanju PCR s spremenljivo temperaturo doseže 90 stopinj
Celzija .Ponavljajoč se postopek širjenja s toploto in krčenja s mrazom je velik izziv za tesnjenje cevi PCR, cev PCR z žlezami pa je razmeroma enostavno povzročiti puščanje.
Priporočljivo je, da reakcijo izvedete s popolnoma zaprtim kompletom/cevjo, da preprečite uhajanje reakcijskega produkta.Bilo bi popolno, če bi lahko izdelali popolnoma zaprt komplet za ekstrakcijo in detekcijo nukleinske kisline.
Nova popolnoma avtomatska naprava za ekstrakcijo in odkrivanje nukleinske kisline New Tech ima torej zgornjih pet optimalnih izbir.
Čas objave: 9. avgusta 2023
